Hoe te testen voor nucleïnezuren

Testing voor nucleïnezuren wordt in de medische diagnostiek uitgevoerd om ziekteverwekkers, zoals virussen of bacteriën te detecteren. Deze tests zijn veel sneller en dus zorgen voor een arts om behandeling voor een patiënt die normaal zou moeten wachten voor bevestiging van de besmetting met meer langdurig en vervelend antilichaam-gebaseerde testen te starten. De werkwijze is ook bekend als een nucleïnezuur amplificatie testen, en omvat een werkwijze bekend als "reverse-transcriptase amplificatie" door polymerase kettingreactie. Aangezien dit een zeer gespecialiseerde wetenschappelijke procedure, geavanceerde kennis en expertise in moleculaire biologie technieken en theorie nodig is. Wat je nodig hebt
PCR-buisjes
PCR cycler
Pipetten en filter tips
Handschoenen
Cellen
Trizol of andere RNA-extractie reagens
PCR-buffer
Taq-polymerase
RT-PCR-primers bij 1 mg /ml concentratie
RNase-vrij water
dNTPs
MgCl2
Random primers bij 1,8 mg /ml concentratie
SuperScript II reverse transcriptase

Toon Meer Aanwijzingen
Verwerking en bereiding van RNA
1

Oogst cellen met een RNA-extractie reagens, zoals Trizol. 1 ml is voldoende om cellen te verzamelen uit een putje van zes-well weefselkweek platen. De cellen worden grondig en neer gepipetteerd om te homogeniseren en vervolgens uitvoeren van de extractie zoals beschreven in de Trizol gegevensblad. Kort, extraheer met chloroform, centrifugeer de fasen van DNA, eiwit en RNA scheiden. Recover alleen de kleurloze RNA-fase en neerslag die met isopropanol. Na incubatie, centrifuges dat en het schoonmaken van de resulterende pellet met diverse ethanol wasbeurten. Dan resuspendeer de pellet in RNase-vrij water. Kopen van 2

Voor reverse transcriptie, denatureren precies 5 microgram RNA bij 65 graden Celsius in een 10 microliter (ul) volume van RNase-vrij water, dan snel plaats op het ijs. Voor elke reactie samen 10 pi RNA, 3 ul 10X PCR-reactiebuffer, 2,5 pi 10 mM dNTP, 6 l 25 mM magnesiumchloride, 1 ul van willekeurige primers van 1,8 milligram per milliliter concentratie en 0,5 ul van SuperScript II reverse transcriptase-enzym. Vul bij elke reactie met 17 ul van RNase-vrij water. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende tien minuten en vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende een uur om de cDNA, dan denatureert produceren bij 95 graden Celsius en snel ijs om de reactie te stoppen.
3

Voor een polymerase kettingreactie, opnieuw opzetten van een reactiemengsel in 0,5 ml buisjes door het combineren van 6 ul cDNA in de reverse transcriptie reactie, 1.5 ul 10X PCR-reactiebuffer, 0,2 pi Taq-polymerase, 0,5 microliter reverse primer en ook van voorwaartse primer, dan bijvullen elke buis met 10,3 ul van RNase-vrij water. Om de reacties te voeren, het opzetten van een PCR-apparaat (dwz een machine die polymeraseketenreacties uitvoert) voor 30 cycli als volgt: 95 graden Celsius gedurende 0,5 minuut te denatureren, gevolgd door de 60 graden Celsius gedurende 45 seconden te gloeien, en tenslotte 72 graden Celsius gedurende 1 minuut om de gesynthetiseerde transcript te verlengen.