Hoe te meten NADH

NAD en NADH zijn beide pyridine nucleotiden betrokken bij de stofwisseling. NADH en NAD zijn co-enzymen in de mitochondria, de krachtcentrales van de cel. Zowel NADH NAD en zijn betrokken bij cellulaire reacties zoals ademhaling en fotosynthese waarbij energie en waterstof worden geproduceerd. NADH en NAD brandstof biochemische reacties die een aantal enzymen vereisen ATP, de belangrijkste energiebron in cellen. Wat je nodig hebt
cellen of weefsel onder studie
NADH testkit
fosfaat-gebufferde zoutoplossing
droogijs
Verwarmingsblok
96 well plaat
Centrifuge
Labeled buizen
Plate reader
Vortex
bekend concentratie van NADH
Toon Meer Aanwijzingen
Assay
1

Was de cellen of weefsel onder studie met koude fosfaat -gebufferde zoutoplossing, PBS. Extract cellen of breken weefsel in extractiebuffer door het plaatsen van het mengsel op droog ijs gedurende 20 minuten en vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Herhalen.

Vortex 2 gedurende 10 seconden. Draaien in een centrifuge gedurende 5 minuten tot pellet cel of weefsel vuil. Verwijder supernatant, de vloeibare fase, en plaats de vloeistof in een schone buis.

Filter supernatant 3 door een gespecialiseerde filter om enzymen die afbraak NADH verwijderen.
4 Verwijder

200 microliter, in een schone buis, verwarm tot 60 graden Celsius in een verwarmingsblok gedurende 30 minuten tot denaturering NAD. Koelen en centrifuge en verwijder vloeibare fase. Breng 50 microliter in een 96-well plaat, elk monster moet in tweevoud of drievoud. Om te bepalen totale NAD, NADT, niet verwarmen.
5

bereiden en toe fietsen mix aan de 96-well plaat. Meng en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 10 microliter ontwikkelaar en laat incuberen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 4 uur. Voeg stop oplossing. Lees kleurverandering op een bord lezer of fluorimeter afhankelijk kit.
Standard Curve en Berekening
6

Bereid een standaard curve door het nemen van een bekende concentratie van NADH en verdunnen in extractiebuffer. Verdunnen in verschillende concentraties, waardoor het einde volume blijft hetzelfde als proefmonsters. Plaat op dezelfde plaat met 96 putjes en testmonsters. Lees optische densiteit.
7

Teken standaard curve grafiek met concentratie op de X-as en de optische dichtheid op de Y-as. Neem een ​​gemiddelde van elk monster en lees de concentratie van de standaard curve grafiek.
8

Bereken de NAD /NADH verhouding door het aftrekken van de totale NAD, NADT, van NADH en vervolgens te delen door NADH.