Hoe te GSH niveaus gebruiken in Opsporen ROS

Glutathion of GSH, is een niet-essentieel tripeptide gemaakt uit cysteïne, glutamaat en glycine. Het is een krachtige antioxidant die de cellen en organen van het lichaam tegen de schadelijke effecten van ROS, of reactieve zuurstof species, die worden gevormd uit moleculaire zuurstof als gevolg van diverse metabole processen in het lichaam beschermt. Antioxidanten, zoals glutathion, neutraliseren ROS en voorkomen dat ze interactie met en beschadiging van de DNA en eiwit in de cellen. De verhouding van geoxideerde en gereduceerde vorm van GSH in het lichaam is indicatief voor de ROS-gerelateerde oxidatieve stress in het lichaam. Wat je nodig hebt
Spuit
Butterfly naald
Centrifuge
Natriumheparine
Freezer
Sulfosalicylzuur
GSH Reaction Agent
Microplaat
Lichtbron
GSH standaardoplossing
Toon Meer Aanwijzingen
1

Trek ongeveer 2 ml bloed door venapunctie op de anticubetal ader met een 23-gauge vlinder naald bevestigd aan een 5 ml spuit. Voeg het monster aan buizen die natrium heparine testen en Zwenk de buis te mengen.
2

Verzamel de rode bloedcellen door centrifugeren van het monster bij 2500 omwentelingen per minuut gedurende vijf minuten. Bevriezen en ontdooien van het monster drie keer om de cellen te breken. Centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 12.000 rpm en 4 °, en verzamel de bovenstaande vloeistof.
3

Verwijder het eiwit uit het monster door het toevoegen van 5 procent sulfosalicylzuur en centrifugeren van het monster bij 12.000 rpm gedurende vijf minuten bij 4 graden. Bewaar het ontdaan supernatant bij -112 graden.
4

Meng een thiol opsporingsmiddel, GSH reductase, nicotinamideadeninedinucleotide fosfaat en assay buffer in proporties door de fabrikant aangegeven kit om de GSH reactiemengsel te maken. Het bedrag van elke chemische stof is afhankelijk van het aantal tests die u wilt uitvoeren. Verdun het reactiemengsel in GSH 5 procent sulfosalicylzuur om concentraties van 16, 32, 63, 125, 250 en 500 microliter krijgen.
5

toevoegen 1-10 microliter van eiwit ontdaan bloedmonster in de putten van een microplaat. Voeg serie verdund GSH standaardoplossing, die in de test kit, aan elk putje van de totale hoeveelheid elk putje brengen 10 microliter.
6

In 90 microliter van GSH reactiemengsel u gemaakte in stap 4 aan elk putje van de microtiterplaat. Meng het reagens door schudden van de plaat gedurende 30 seconden.

Maatregel 7 de absorptie direct door het plaatsen van de plaat onder licht met golflengten van 405 en 415 nanometer. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten. Neem absorptieaflezingen na elke vijf minuten tijdens de incubatie.
8

Verdun 6 millimolar van de verwerkte monster met 5 procent sulfosalicylzuur en trifluromethane sulfonaat oplossing. Dit zal al de verminderde GSH uit de oplossing te verwijderen. Voeg 1-10 micoliters van de oplossing op putjes van microplaat en herhaal stappen 5, 6 en 7. Dit zal helpen inschatten dat de geoxideerde GSH in het monster.

Plot 9 de absorptie en monsterconcentraties een grafiek om de GSH curve voor zowel gereduceerd en geoxideerd glutathion verkrijgen. Bereken de verhouding tussen beide vormen van GSH. Verhoogde oxidatieve GSH niveaus aangeven oxidatieve stress en ROS.