Celoppervlak Biotinylatie Protocol

Biotinylering gebruikt het vermogen van het oplosbare vitamine biotine te binden aan cel eiwitten. Biotine bindt aan het eiwit streptavidine en is daarom bruikbaar bij celbiologie naar cel eiwitten te visualiseren. Biotinylering kan de veilige labeling van eiwitten vergeleken met technieken zoals radioactiviteit en heeft geen invloed op de normale werking van de cel. Het stelt onderzoekers cel eiwitten zoals receotiren en waarmee een beter begrip van ziekten en ziekteprocessen. Labeling gesuspendeerde cellen

Wash cellen appartementen in ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om verontreinigingen te verwijderen. Buffers met tris-en glycine zal concurreren met biotinylering en moet worden vermeden. Om te voorkomen biotinyleren interne eiwitten kan het etiket worden uitgevoerd bij 4 ° C of in aanwezigheid van azide. Resuspendeer cellen in PBS en de oplosbare biotine, sulfo-NHS-LC-biotine.
Labeling hechtende cellen

Wash cellen appartementen in PBS en geïncubeerd met een product zoals sulfo -NHS-LC-biotine. De cellen worden vervolgens geschraapt in een schaal en gelyseerd in een buffer die het detergent Triton X-100 en voorbereid voor visualisatie.
Voorbereiden gelabelde cellen

Na incubatie worden de cellen tot een pellet gecentrifugeerd en in PBS gewassen. De cellen worden opnieuw gesuspendeerd in PBS en gezuiverd met IgG-Sepharose gel. Het gebonden eiwit wordt verdund in laadbuffer en verwarmd tot 100 graden Celsius.
Visualiseren Cellen

Verdund
eiwitten kunnen worden gevisualiseerd met natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS- PAGE) gevolgd door blotting met het eiwit en enzymmengsel, streptavidine-mierikswortel peroxide. Blots worden gevisualiseerd met een chemische reactie --- chemiluminescentie --- die licht uitzendt. Specificiteit van de biotinylatie kan worden bevestigd met antilichamen voor het eiwit onder studie.