Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te bestuderen. Hier zijn enkele veelgebruikte technieken:

1. Co-immunoprecipitatie (Co-IP) :Co-IP is een veelgebruikte techniek voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties. Het omvat de immunoprecipitatie van één eiwit (aaseiwit) uit een cellysaat met behulp van een antilichaam dat specifiek is voor het aaseiwit. Het immunogeprecipiteerde eiwitcomplex wordt vervolgens geanalyseerd om andere eiwitten (prooi-eiwitten) te identificeren die een interactie aangaan met het aaseiwit. Co-IP kan worden gevolgd door verschillende stroomafwaartse analysemethoden, zoals Western blotting, massaspectrometrie of immunofluorescentiekleuring.

2. Pull-down-assays :Pull-down-assays zijn gebaseerd op het principe van affiniteitschromatografie. Een aaseiwit wordt geïmmobiliseerd op een vaste drager (zoals magnetische kralen of agarosehars) door covalente binding of fusie met een tag (bijvoorbeeld GST of His-tag). Het cellysaat of het gezuiverde eiwitmengsel wordt vervolgens geïncubeerd met het geïmmobiliseerde aaseiwit. Na het wassen om ongebonden eiwitten te verwijderen, worden de interacterende eiwitten (prooi-eiwitten) geëlueerd en geanalyseerd.

3. Fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) :FRET is een techniek die de energieoverdracht meet tussen twee dicht bij elkaar gelegen fluoroforen (donor en acceptor). Wanneer de donor- en acceptorfluoroforen zich dicht bij elkaar bevinden (typisch binnen 10-100 Å), resulteert de excitatie van de donorfluorofoor in de emissie van licht door de acceptorfluorofoor. Deze energieoverdracht kan worden gekwantificeerd en gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te volgen. FRET kan op verschillende manieren worden geïmplementeerd, waaronder het labelen van eiwitten met specifieke fluoroforen of het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP en RFP).

4. Biomoleculaire interactieanalyse (BIA) :BIA, ook bekend als Surface Plasmon Resonance (SPR), is een labelvrije techniek die veranderingen in de brekingsindex meet op het grensvlak van een glasplaatje en een stromende vloeistof. Eén van de interacterende eiwitten wordt op het glasoppervlak geïmmobiliseerd en het andere eiwit wordt over het oppervlak geleid. De interactie tussen de eiwitten leidt tot veranderingen in de brekingsindex, die kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd. BIA kan informatie verschaffen over de bindingsaffiniteit en kinetiek van eiwit-eiwitinteracties.

5. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) :ITC is een techniek die de warmteverandering meet die gepaard gaat met de interactie tussen twee moleculen. Wanneer eiwitten interageren, komt er warmte vrij (exotherm) of geabsorbeerd (endotherm). ITC kan de bindingsaffiniteit (Kd) en thermodynamische parameters, zoals enthalpieverandering (ΔH) en entropieverandering (ΔS), van eiwit-eiwitinteracties kwantificeren.

6. Eiwitinteractiearrays :Eiwitinteractiearrays omvatten de high-throughput screening van eiwit-eiwitinteracties in een microarrayformaat. Duizenden verschillende eiwitten of peptiden worden op een vast oppervlak geïmmobiliseerd en de binding van een specifiek eiwit van belang wordt gedetecteerd met behulp van gelabelde antilichamen of andere detectiemethoden. Deze techniek maakt een snelle en grootschalige analyse van eiwit-eiwitinteracties mogelijk.

7. Gist-twee-hybride (Y2H)-test :De Y2H-test is een genetische methode die wordt gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in gistcellen te identificeren. Het omvat het fuseren van de coderende sequenties van twee eiwitten aan twee verschillende domeinen van een transcriptiefactor. Als de twee eiwitten een interactie aangaan, wordt de transcriptiefactor gereconstitueerd, wat leidt tot de expressie van een reportergen. Positieve interacties worden geïdentificeerd op basis van de groei van gistcellen op selectieve media of colorimetrische testen.

De keuze van de methode voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties hangt af van de specifieke eiwitten van interesse, de beschikbaarheid van reagentia en apparatuur, en het gewenste informatieniveau. Combinaties van deze technieken kunnen ook worden gebruikt om uitgebreide inzichten te verkrijgen in eiwit-eiwitinteracties.