Het bepalen van het eindpunt van een trypsine-caseïnehydrolyse-experiment door te observeren wanneer de oplossing helder wordt, kan subjectief en onnauwkeurig zijn. Een meer kwantitatieve en nauwkeurige methode is om een ​​spectrofotometer te gebruiken om de absorptie van de oplossing bij een specifieke golflengte te meten.

Hier is een verbeterde procedure voor het bepalen van het eindpunt van het trypsine-experiment met behulp van een spectrofotometer:

Materialen:

- Trypsine-oplossing

- Caseïnesubstraatoplossing

- Natriumhydroxide (NaOH) oplossing (0,1 M)

- Spectrofotometer

- Cuvetten

Procedure:

1. Bereid het reactiemengsel:

- Meng in een cuvet een specifiek volume caseïnesubstraatoplossing (bijvoorbeeld 1 ml) met een geschikt volume trypsine-oplossing (bijvoorbeeld 0,1 ml).

- Incubeer het mengsel bij een geschikte temperatuur (bijvoorbeeld 37°C) gedurende een gewenste tijd (bijvoorbeeld enkele minuten).

2. Stop de reactie:

- Trek op specifieke tijdsintervallen (bijvoorbeeld elke minuut) een klein volume van het reactiemengsel (bijvoorbeeld 0,1 ml) op en breng dit over naar een aparte cuvet.

- Voeg onmiddellijk een voldoende volume natriumhydroxideoplossing toe (bijvoorbeeld 1 ml) om de reactie te stoppen.

3. Meet de absorptie:

- Gebruik de spectrofotometer om de absorptie van elk gestopt reactiemengsel bij een specifieke golflengte (bijvoorbeeld 440 nm) te meten.

4. Plot de absorptie:

- Maak een grafiek met de tijd (x-as) en de absorptie (y-as).

5. Bepaal het eindpunt:

- Analyseer de absorptiewaarden in de loop van de tijd. Het eindpunt is het tijdstip waarop de absorptie een plateau bereikt of een significante afname vertoont, wat wijst op de uitgebreide hydrolyse van caseïne.

Deze methode biedt een meer objectieve en kwantitatieve bepaling van het eindpunt in vergelijking met het visueel observeren van de klaring van de oplossing, omdat deze berust op het meten van de verandering in absorptie als gevolg van de afgifte van kleinere peptiden en aminozuren tijdens de hydrolyse van caseïne.