Western blotanalyse is een bekende techniek voor het identificeren van specifieke eiwitten geïsoleerd uit weefsel . De verschillende eiwitten worden eerst gescheiden door lading en gewicht op SDS - polyacrylamidegel en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan . Na overdracht gemerkte antilichamen binden specifiek het gewenste eiwit en zijn gefotografeerd met röntgenfilm of gevisualiseerd door proteïne - specifieke kleurstof . Het uiteindelijke resultaat toont donkere banden die de aanwezigheid van de geïdentificeerde eiwitten . Dit artikel richt zich op de basismethodiek voor het uitvoeren van Western Blot analyse in een laboratorium gekwalificeerd voor complexe eiwit onderzoek. Wat je nodig hebt
SDS - polyacrylamide gel ( SDS -PAGE ) met gescheiden eiwitten
nitrocellulose membraan
Gedistilleerd water
Transfer buffer ( 30 g Tris , 144 g Glycine en 200 ml methanol in 1 l water ) op Twitter Filter papier , Whatman 3 mm
Laboratorium spons
Western Blot overdrachtskamer
Laboratory power supply
Laboratorium koelkast
Laboratorium agitator
Tris gebufferde zoutoplossing ( TBS ) ( 24,2 g Tris Base , 80 g NaCl in 1 l water ) op Twitter blokkeren oplossing ( 5 procent magere melkpoeder in TBS ) op primaire antilichaam oplossing
gelabelde antilichaamconjugaat oplossing
alkalischefosfatasesubstraat oplossing met nitro blauw tetrazolium vlek
fosfaat gebufferde zoutoplossing ( PBS ) op Gel - imager box
Toon meer instructies
Transfer Eiwitten naar nitrocellulosemembraan
1

Bereid de nitrocellulose membraan. Het membraan moet worden geweekt in gedestilleerd water gedurende twee minuten , vervolgens geplaatst in de overdracht buffer en mocht vijf minuten inweken . Kopen van 2

Monteer een transfer sandwich die uit spons /filterpapier /SDS-PAGE /nitrocellulose membraan /filterpapier /spons . De sandwich is uitgelijnd zodat het membraan ligt dichter bij de anode en de gel dichter bij de kathode in de overdrachtskamer .
3

Overdr.contact buffer in de kamer zodat de sandwich wordt ondergedompeld . Plaats de kamer in het laboratorium koelkast . Overdracht van eiwit uit de gel naar het membraan worden uitgevoerd bij 4 graden Celsius.
4

Stel de voeding eiwitten dragen van de gel op het membraan . De richting van de overdracht is de richting van de aangegeven door de rode draad anode . Grotere proteïnen bewegen sneller in reactie op een elektrische stroom verschijnt eerst bewegen. De voeding regelt de snelheid van de overdracht . Stel de stroom in 30 V en 40 mA voor een overnachting overdracht .
5

Demonteer de voeding na de overdracht is voltooid . Geen contact met de overdracht buffer niet bellen of verwijder de sandwich terwijl de voeding is aangesloten .
6

Verwijder het membraan uit de sandwich en incubeer gedurende twee uur in het blokkeren van oplossing . Eiwitten in de blokkerende oplossing zal absorberen in het membraan , waar geen eiwitten aanwezig zijn . Het zal voorkomen antilichaam binden aan het membraan wanneer het gewenste eiwit niet aanwezig .
Binding Antilichaam
7

Incubeer het nitrocellulosemembraan met primair antilichaam oplossing met een agitator . Het membraan moet volledig ondergedompeld in de oplossing gedurende ten minste een uur . Het is acceptabel om 's nachts broeden .
8

Was de membraan grondig om ongebonden antilichaam te verwijderen . Vier afzonderlijke 10 minuten wassen met TBS zijn meestal voldoende om het overtollige antilichaam te verwijderen .
9

Incubeer het membraan in gelabelde antilichaam conjugaat oplossing met behulp van het roerwerk . Het membraan moet gedurende ten minste een uur . De gemerkte antilichaam conjugaat gebonden aan alkalische fosfatase . Het is het enzym - antilichaam mix die zal herkennen en binden aan het eerste antilichaam .
Detectie van eiwit
10

het membraan gedurende 10 minuten spoelen in PBS viermaal . Dit zal de rest van het gemerkte antilichaam conjugaat te verwijderen.
11

Incubeer het membraan in alkalischefosfatasesubstraat oplossing totdat band patronen verschijnen . De kleurstof in de substraatoplossing zullen binden aan het antilichaam - antigeen - eiwit in de membraan en vormen een donkere band . Het proces kan worden onmiddellijk of eisen tot 30 minuten voordat de banden worden waargenomen .
12

Wikkel het membraan volledig in cellofaan en plaats het direct op de gel - imager om de resultaten te visualiseren . De gel - imager is in staat om het fotograferen van de weergegeven op de Western Blot membraan resultaten .