In de meeste biologische experimenten met celkweek , een cruciale stap omvat weten welke cellen in leven zijn en die in je steekproef dood zijn . Kleurstofuitsluiting is de meest populaire methode om cellevensvatbaarheid . Kleurstofuitsluiting is gebaseerd op de theorie dat levende cellen bevatten vliezen en dode cellen niet , waardoor dode cellen absorberen de kleurstof in het cytoplasma . Er zijn verschillende kleurstoffen en protocollen en de methoden die u kiest moet gebaseerd zijn op de kosten , de gevoeligheid , het gemak en de lengte van de procedure . Trypan blauw is een gemeenschappelijk kleurstof gebruikt om cellevensvatbaarheid te meten omdat de procedure kan in vijf tot 10 minuten en kost slechts de hoeveelheid van de kleurstof reagens . Wat je nodig hebt
0,4 % trypanblauw reagens
hemacytometer Beschermhoes slip
Micropipet
Pipetpunten
fosfaat gebufferde zoutoplossing ( PBS ) op Licht
microscoop
Toon meer instructies
1

Zorg voor een pellet van de cellen dat je meet .

Resuspendeer 2 de cel pellet in PBS tot ongeveer 5 x 105 cellen /ml te krijgen . PBS wordt gebruikt omdat de levensvatbaarheid nauwkeuriger zijn wanneer cellen in een serumvrij milieu ; serum -eiwitten kunnen ook vlekken en geven u misleidende resultaten .
3

Voeg gelijke delen van celsuspensie in PBS om gelijke delen van 0,4 % trypan blauwe kleurstof om een 1-2 verdunning ( bijvoorbeeld verkrijgen : . 100 ul cellen 100 ul trypan blauw) en meng door en neer te pipetteren
4

Incubeer het mengsel minder dan drie minuten bij kamertemperatuur . Als cellen worden geteld na ongeveer vijf minuten , zal levensvatbaarheid onnauwkeurig vanwege celdood .
5

Met de cover slip al op zijn plaats , vul elke zijde van een hemacytometer teller met de celsuspensie . Gewoonlijk zal elke zijde 10 tot 20 ul Elke zijde van nemen .

6 de hemacytometer op het podium van een lichtmicroscoop en focus op de cellen .
7

de hemacytometer bevat meerdere pleinen . Tel het aantal cellen in een vierkant van de hemacytometer . Tel dan het aantal niet - levensvatbare ( blauw) en levensvatbare ( duidelijke ) cellen afzonderlijk , aan hetzelfde plein .
8

Bereken het percentage van levensvatbare cellen op het plein door het aantal levensvatbare cellen te delen het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100 . Doe dit voor meerdere vierkantjes op de hemacytometer om een gemiddelde levensvatbaarheid meting te verkrijgen .