NAD en NADH zijn beide pyridine nucleotiden betrokken bij de stofwisseling . NADH en NAD co- enzymen in de mitochondria , de krachtcentrales van de cel . Zowel NADH NAD en zijn betrokken bij cellulaire reacties zoals ademhaling en fotosynthese waar energie en waterstof worden geproduceerd . NAD en NADH brandstof biochemische reacties die een aantal enzymen vereisen om ATP , de belangrijkste energiebron in cellen . Wat je nodig hebt
cellen of weefsel onder studie
NADH testkit
fosfaat - gebufferde zoutoplossing
droogijs
Verwarming blok
96 well plaat
Centrifuge
gelabelde buizen
Plate reader
Vortex
bekend concentratie van NADH
Toon meer instructies
Assay
1

Was de cellen of weefsel onder studie met koude fosfaat - gebufferde zoutoplossing , PBS . Extract cellen of breken weefsel in extractiebuffer door het plaatsen van het mengsel op droog ijs gedurende 20 minuten en vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten . Herhalen. Kopen van 2

Vortex gedurende 10 seconden . Draaien in een centrifuge gedurende 5 minuten naar cel of weefsel vuil pelleteren . Verwijder supernatant , de vloeibare fase , en plaats de vloeistof in een schone buis .

Filter 3 supernatant door een gespecialiseerde filter om enzymen die zal uitsplitsing NADH .
4 verwijderen

Verwijder 200 microliter , plaats in een schone buis en warmte bij 60 ° C in een verwarmingsblok gedurende 30 minuten denatureren NAD . Koel en centrifuge en verwijder vloeistoffase. Breng 50 microliter in een 96 - well plaat ; elk monster moet in twee-of drievoud . Om een ​​totale NAD bepalen NADT , niet verwarmen.
5

voorbereiden en voeg fietsen mix aan de 96- well plaat . Meng en incubeer gedurende 5 minuten . Voeg 10 microliter van ontwikkelaar en laten incuberen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 4 uur . Voeg stop oplossing . Lees kleurverandering op een bord lezer of fluorimeter afhankelijk kit.
Standard Curve en Berekening
6

Bereid een standaard curve door het nemen van een bekende concentratie van NADH en verdunnen in extractie buffer. Verdun in verschillende concentraties , waardoor het einde volume blijft hetzelfde als monsters . Plaat op dezelfde plaat met 96 putjes als testmonsters . Lees optische dichtheid .
7

Draw standaard curve grafiek met concentratie op de X-as en de optische dichtheid op de Y-as . Neem een gemiddelde van elk monster en lees de concentratie van de standaard curve grafiek .
8

Bereken de NAD /NADH verhouding door het aftrekken van de totale NAD , NADT , van NADH en vervolgens te delen door NADH . < Br
>